RNAscope在皮膚成纖維細胞單細胞測序后驗證中的應(yīng)用
單細胞測序技術(shù)是近年來迅速發(fā)展的生命科學前沿技術(shù)，它在單細胞水平揭示細胞的基因表達狀態(tài)，反映細胞間的異質(zhì)性，為生命科學的研究提供了獨特的視角。近年來，單細胞測序技術(shù)在神經(jīng)科學、腫瘤、發(fā)育生物學、微生物學等眾多領(lǐng)域發(fā)揮著重要的作用，成為了生命科學極具潛力的熱點研究工具。單細胞測序結(jié)果的真實性，不同檢測信息在組織中的特異分布，與檢測結(jié)果的生物學意義密切相關(guān)。故在單細胞測序后重要靶點的原位回溯具有重要的生物學分析意義。RNAscope原位雜交技術(shù)能直觀可視化基因表達的空間位置，無懼新發(fā)現(xiàn)靶點無免疫組化抗體，分泌因子或者靶點為非編碼RNA等情況，因此RNAscope對于單細胞測序的結(jié)果回溯到組織原位上進行驗證提供了重要的技術(shù)手段。本文為大家解讀2020年發(fā)表的使用RNAscope技術(shù)在單細胞測序后驗證中的應(yīng)用系列文章。
2020年在communication biology上發(fā)表的一篇題為Single-cell Transcriptomes of The Human Hkin Reveal Age-related Loss of Fibroblast Priming的研究中，利用單細胞測序系統(tǒng)分析了人皮膚成纖維細胞的轉(zhuǎn)錄組，鑒定了四個主要的成纖維細胞亞群，這些亞群可以在空間上定位并顯示不同的分泌、間充質(zhì)和促炎功能，為人類真皮成纖維細胞的功能特化提供了證據(jù)，并且發(fā)現(xiàn)細胞特性的部分喪失是人類真皮中與年齡相關(guān)的重要變化。
在這項研究中，研究人員從兩名年輕（25歲和27歲）和三名年長（53歲、69歲和70歲）的捐贈者身上獲取了全皮膚樣本，而且為了盡量減少皮膚的光老化效應(yīng)，這些樣本是從男性捐贈者的防曬區(qū)域的腹股溝髂區(qū)獲得的。然后對獲得的皮膚樣本進行單細胞測序，單細胞測序結(jié)果以及數(shù)據(jù)分析鑒定了4個成纖維細胞亞群，第一個亞群是位于網(wǎng)狀真皮中的分泌性網(wǎng)狀成纖維細胞，第二個亞群是位于乳頭狀真皮中的分泌性乳頭狀成纖維細胞，第三個亞群被預測具有廣泛的定位，顯示出更大的間充質(zhì)潛能的間充質(zhì)成纖維細胞，第四個亞群是促炎癥細胞群（見下圖）。
為了進一步表征和驗證單細胞測序鑒定的四個成纖維細胞亞群，研究人員使用Bio-Techne旗下ACD公司的RNAscope技術(shù)，在福爾馬林固定石蠟包埋（FFPE）皮膚切片中原位檢測了每個亞群最具代表性的標志基因的表達。研究人員使用的是RNAscope多通道熒光檢測的方法，分別檢測了分泌性網(wǎng)狀成纖維細胞的標志基因CTHRC1（下圖a中綠色信號點）和分泌性乳頭狀成纖維細胞的標志基因APCDD1的表達（下圖a中紅色信號點），并檢測了泛成纖維細胞標志基因PDGFRA的表達作為對照（下圖a中白色信號點），RNAscope的檢測結(jié)果證實了每個分泌亞群在乳頭狀真皮層和網(wǎng)狀真皮層中的位置，并且通過RNAscope結(jié)果的定量分析可以統(tǒng)計分別表達CTHRC1與APCDD1的陽性細胞比例，從而得到在乳頭狀真皮層和網(wǎng)狀真皮層中兩個分泌亞群細胞的相對數(shù)量。
對于另外兩個成纖維細胞亞群，研究人員同樣使用RNAscope多通道熒光檢測的方法，分別檢測了促炎成纖維細胞的標志基因CCL19與APOE的表達（下圖b中綠色信號點為RNAscope檢測到的CCL19的RNA信號，紅色信號點為APOE的RNA信號），與間充質(zhì)亞群的標志基因ASPN的表達（下圖c中綠色信號點）。RNAscope的檢測結(jié)果證實促炎成纖維細胞顯示出更廣泛的分布，在脈管中的分布證實其與血管系統(tǒng)的優(yōu)先關(guān)聯(lián)。間充質(zhì)亞群主要定位于網(wǎng)狀真皮，尤其是毛囊附近。因此，RNAscope原位檢測結(jié)果為研究人員通過單細胞轉(zhuǎn)錄組學獲得的發(fā)現(xiàn)提供了重要的證據(jù)，并為檢測特定成纖維細胞亞群建立了標記。
RNAscope技術(shù)是由Bio-Techne旗下Advanced Cell Diagnostics (ACD)公司研發(fā)的RNA原位雜交產(chǎn)品，在近年來的生物檢測領(lǐng)域發(fā)展迅速。與傳統(tǒng)的RNA原位雜交相比，RNAscope技術(shù)屬于新一代RNA原位雜交技術(shù)，其特異性的雙Z探針設(shè)計避免了傳統(tǒng)長鏈RNA探針的弊端，配以自身級聯(lián)放大檢測原理，可以高效敏感地檢測到目標RNA。該方法的具體優(yōu)勢如下：
應(yīng)用廣泛
使用RNAscope技術(shù)，靶點RNA為大于等于300個堿基的特異序列，即可進行探針設(shè)計。因而RNAscope技術(shù)可以應(yīng)用于幾乎所有物種，所有組織以及所有基因的檢測。
特異性強
RNAscope獨特的雙Z（ZZ） 探針設(shè)計有效的防止了探針的非特異性結(jié)合，同時降低了背景干擾。由于結(jié)合在非特異性位點的單個的Z 探針不會產(chǎn)生完整的信號放大分子結(jié)合位點，并會在雜交過程中被洗脫掉，從而防止非特異性信號的放大，使得探針的信號具有高度特異性。探針設(shè)計合成需要2~4周時間即可完成。
靈敏度高
RNAscope方法檢測每個RNA 分子時，只需三對雙Z（ZZ）探針即可完成雜交和信號的可視化。
單分子可視化和單細胞定量
使用RNAscope技術(shù)雜交上三對及以上雙Z 探針即可在標準的顯微鏡下呈現(xiàn)可觀察到的點狀信號。ACD公司提供的分析軟件更可以定量每一個單細胞內(nèi)RNA 的表達水平。
兼容降解的RNA
由于RNAscope三對雙Z探針即可檢測到目標RNA，而通常針對靶點RNA設(shè)計的探針為20對雙Z 探針，因而即使目標RNA發(fā)生部分降解，仍可以穩(wěn)定有效地檢測到靶點RNA。
檢測結(jié)果穩(wěn)定一致性
RNAscope技術(shù)用到的探針以及所有檢測試劑全部由工業(yè)化合成，且該技術(shù)針對不同樣本類型（冰凍切片， 石蠟切片，懸浮細胞，貼壁細胞等）已經(jīng)有成熟的實驗操作流程，故使得RNAscope技術(shù)檢測結(jié)果具有穩(wěn)定性和一致性。除了可以在實驗室進行手工操作外，該產(chǎn)品也可以在Leica以及羅氏Ventana自動平臺上運行，為結(jié)果的一致性和穩(wěn)定性提供了可靠的依據(jù)。
多通道多靶點同時檢測
由于RNAscope技術(shù)可以同時進行多通道探針雜交以及信號放大，故在可見光檢測中可以在同一張切片上同時檢測兩個靶點；而在熒光檢測過程中，可以在同一張切片上檢測三個或三個以上靶點RNA。
References
1. Lloren? Solé-Boldo, Günter Raddatz, Sabrina Schütz, et al. Single-cell transcriptomes of the human skin reveal age-related loss of fibroblast priming. Commun Biol. 2020; 23;3(1):188.
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